棉铃虫中肠cDNA文库的构建及EST分析

中肠是苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)发挥作用的主要部位，中肠上很多蛋白被认为是Bt毒素的结合蛋白。为了探索棉铃虫Helicoverpaarmigera对Bt的抗性机制，我们运用RNA转录过程中的5′末端转换机制(SwitchingMechanismat5′endoftheRNATranscript,SMART）技术构建了棉铃虫中肠的cDNA文库。先提取棉铃虫5龄幼虫中肠组织的总RNA，合成双链cDNA，经过均一化处理后，酶切、连接载体、转化到大肠杆菌Escherichiacoli感受态细胞，最后进行滴度测试、文库扩增并进行EST序列测定。对该文库质量分析表明：文库滴度为2×106pfu/mL，重组率为100%，平均插入片段大于1kb，全长率为50%。最终成功得到1098条表达序列标签(expressedsequencetags,ESTs)序列，经Phrap程序聚类拼接后得到789条单基因簇(unigene)，包括132个重叠群(congtigs)和657个单拷贝(singlets)。将聚类拼接后的789条ESTs序列在NT，NR和SWISSPORT库中进行本地化搜索，比对后发现：218条序列(27.62%)没有注解；119条序列(15.08%)注解不明确；452条序列（57.29%）有功能注解，并表达300多种基因产物。构建的文库各项指标均达到要求，该文库的构建为棉铃虫中肠各类基因的克隆及功能分析奠定了基础。