家蚕吡哆醛激酶基因定点突变及突变体功能

【目的】吡哆醛激酶（pyridoxalkinase，PLK）是维生素B6关键代谢酶。前期研究克隆出家蚕Bombyxmori吡哆醛激酶cDNA，经序列比对发现几个重要且保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。为明确家蚕吡哆醛激酶分子若干特定位置上氨基酸残基在酶功能上的作用进行本研究。【方法】采用重叠延伸法对家蚕吡哆醛激酶Thr47，Asn121，Ile54，Arg88和Trp230氨基酸残基进行定点突变，构建表达载体pET-22b（+）-PLK并转入大肠杆菌EscherichiacoliRosetta中进行诱导表达，经亲和层析对重组蛋白进行纯化，通过酶活性检测进行功能鉴定。【结果】家蚕吡哆醛激酶Thr47，Ile54和Arg88氨基酸突变后酶的催化活力分别下降82%，58%和85%；Asn121突变对酶的催化活力几乎没有影响；而Trp230突变导致酶丧失催化活性。【结论】本研究明确了选定氨基酸侧链基团在家蚕吡哆醛激酶催化功能上的意义。