棉铃虫P450基因HarmCYP9A33的克隆、序列分析及原核表达

夜间活动昆虫如夜蛾类主要通过嗅觉来寻找配偶、寄主植物和产卵场所，是研究昆虫嗅觉分子机制的理想材料。P450为多功能单加氧酶，在昆虫对各种内源与外源物质的代谢中起重要作用。为研究P450在昆虫嗅觉中的作用，本研究采用RT-PCR和RACE技术，从夜蛾科昆虫棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)雄蛾触角中扩增得到一条全长1772bp的P450基因，命名为HarmCYP9A33(GenBank登录号为JX486677)。序列分析表明，HarmCYP9A33开放阅读框全长1590bp，编码529个氨基酸残基，预测蛋白质分子量和等电点分别为61.62kD和7.97；HarmCYP9A33与甘蓝夜蛾Mamestrabrassicae触角毛形感器中高表达的MbraCYP9A13蛋白的氨基酸序列一致性最高，达75%，蛋白二级结构相似，6个底物识别位点(substraterecognitionsites，SRSs)序列一致性达61%，其中底物与酶结合通道开关Ⅰ螺旋中SRS4序列完全相同，与棉铃虫CYP9A亚家族蛋白有一定的结构相似性。Real-timePCR检测表明,HarmCYP9A33在雌、雄蛾各组织中均有表达，以腹部表达量最高，其次为头部；在卵至成虫各个时期也均表达，以蛹中表达量最高；在触角中的表达量随羽化时间而变化，且多高于卵和幼虫中的表达量。SDS-PAGE检测和Westernblot鉴定表明HarmCYP9A33体外融合表达成功。本研究为深入探讨该基因在棉铃虫触角感器细胞中的定位及其生物学功能奠定了基础。