丽蝇蛹集金小蜂Pacifastin蛋白酶抑制剂基因nvpp-1和nvpp-2的功能研究

Pacifastin蛋白酶抑制剂在昆虫免疫与发育中起着重要作用。为了明确其在寄生蜂中的相关功能，本研究分别克隆获得编码丽蝇蛹集金小蜂Pacifastin蛋白酶抑制剂开放阅读框的cDNA序列nvpp-1和nvpp-2，序列长度分别为723和888bp，分别编码240和295个氨基酸残基。预测结果表明，nvpp-1和nvpp-2推导氨基酸序列N端均含一个长度为17个氨基酸残基的信号肽序列。序列分析和进化树构建结果表明，NVPP-1和NVPP-2分别含有5个和4个典型的Pacifastin保守结构域，并与疑黑瘤姬蜂Pimplahypochondriaca毒液蛋白CVP4聚为一类。实时荧光定量RT-PCR结果表明，nvpp-1和nvpp-2于该蜂雌蜂各组织中均发生转录，且在胸、腹部残体（解剖后腹部剩余部分）和毒器官中的转录水平较高；于毒器官中，其在羽化初期（0和1d）转录水平较高，其转录水平显著降低。Westernblot结果表明，NVPP-1和NVPP-2均只在毒液中被大量检出，在其他待测组织中均未被检出，而刚羽化时（0d）其在毒液中含量较低。利用pET-28a(+)载体分别对nvpp-1和nvpp-2进行了原核表达，并对重组表达产物进行纯化。分别测定重组NVPP-1和NVPP-2对4种不同丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K和弹性蛋白酶）的抑制效果，结果表明，重组NVPP-1和NVPP-2分别能显著抑制糜蛋白酶和胰蛋白酶活性。同时还分别测定了两种重组蛋白对寄主家蝇蛹血淋巴自身的酚氧化酶活性及原酚氧化酶激活反应的影响，结果表明，重组蛋白对家蝇蛹血淋巴原酚氧化酶激活反应亦有抑制效果，但其均不能显著影响血淋巴自身的酚氧化酶活性。综上所述，丽蝇蛹集金小蜂毒液中含有Pacifastin蛋白酶抑制剂NVPP-1和NVPP-2，分别为糜蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂家族成员，均能显著影响寄主家蝇蛹血淋巴原酚氧化酶激活反应，从而削弱寄主体液免疫水平。本研究所获结果加深了我们对昆虫尤其是寄生蜂Pacifastin蛋白酶抑制剂作用的认识。