棉铃虫蜕皮调节转录因子在大肠杆菌中的重组表达及其包涵体纯化

蜕皮调节转录因子(hormonereceptor3，HR3)在昆虫蜕皮过程中启动蜕皮相关早期基因簇表达，并抑制蜕皮相关晚期基因簇表达，对昆虫蜕皮级联反应起着关键的调控作用。利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了棉铃虫Helicoverpaarmigera蜕皮调节转录因子(HHR3)，并与pGEX-4T-1载体连接，在大肠杆菌EscherichiacoliDH5α内进行扩增，经过PCR筛选获得了HHR3-pGEX-4T-1重组质粒。用该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21并进行诱导表达，获得了与谷胱甘肽-S转移酶（GST）融合表达的HHR3包涵体，分子量在94kD左右，通过无离子去垢剂CAPS（3-［cyclohexylamino］-1-propanesulfonicacid）变性、复性后获得了可溶性GST-HHR3融合蛋白，经凝血酶裂解和SDS-PAGE分离得到纯化的HHR3，经蛋白质N-端测序确认表达正确。用重组表达的HHR3免疫家兔，制备了兔抗HHR3多克隆抗体，免疫印迹检测显示该抗体对HHR3有特异性识别能力,可以用于HHR3功能与调控等下游研究。免疫印迹检测结果还表明，HHR3在5龄向6龄蜕皮的幼虫脂肪体中高表达，在进入6龄24h的幼虫脂肪体中含量明显下降，在6龄72h的幼虫中肠中没有检测到HHR3表达；成虫卵巢中有HHR3表达。