烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达

利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术从烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guenée)雌虫卵巢中扩增得到了组织蛋白酶B酶原基因（cathepsinB，CB）cDNA片段，将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明，该片段长度为1017bp，含有组织蛋白酶B酶原基因完整开放阅读框架（ORF）（GenBank登录号：EF154237）。序列分析结果显示：烟夜蛾组织蛋白酶B（HassCB）编码338个氨基酸残基，预测N-末端含有长度为21个氨基酸残基的信号肽序列；去除信号肽序列后，预测成熟蛋白分子量为35.5kDa，等电点为5.96。氨基酸序列比对结果表明，HassCB与其他昆虫的组织蛋白酶B酶原氨基酸序列有较高的一致性。将去除信号肽序列的HassCB（HassCBa）重组到表达载体pGEX-4T-1中，并转入原核细胞中表达，SDS-PAGE和Western印迹分析表明：该基因能在大肠杆菌BL21中表达，电泳检测到一条大约61kDa的目的条带，与预测的融合蛋白分子量相符。用该基因制备多克隆抗体并测得该抗体对重组表达的HassCBa的效价为1∶51200。通过免疫印迹检测证实，此抗体既能识别重组表达的HassCBa，又能识别烟夜蛾卵巢匀浆液中的HassCB。