家蝇泛素编码区cDNA序列的克隆及在原核细胞中的表达

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasomepathway)是具有高度选择性的蛋白质降解途径，该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用。本研究根据GenBank已登录的真核生物泛素（ubiquitin）编码框的氨基酸序列，设计一对简并引物，RT-PCR克隆了家蝇Muscadomestica泛素基因的编码区cDNA序列，并进行了测序。序列分析表明，该编码区的长度为228bp，编码76个氨基酸，命名为Mdubi，GenBank登录号为DQ115796。同源性比较发现，Mdubi氨基酸序列与其他真核生物泛素编码框同源性可达94%以上。RT-PCR检测表明，Mdubi在家蝇不同组织中均高效表达，且不受大肠杆菌Escherichiacoli刺激的影响，是遍在性表达。为进一步研究Mdubi的结构和功能，将Mdubi克隆到原核表达载体pQE30上，构建重组质粒pQE30-UBI，转化大肠杆菌M15感受态细胞，在IPTG诱导下进行了高效表达，SDS-PAGE检测表明Mdubi在大肠杆菌中可表达相对分子质量为9.6kD的可溶性融合蛋白；Westernblot分析表明表达产物能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合，表明表达的Mdubi为N端带有6His标签的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了Mdubi，以该融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗Mdubi血清。本研究成功克隆了家蝇泛素的编码序列，并在原核细胞中得到了表达，为进一步研究泛素在家蝇体内的作用机制奠定了基础。