洛氏脊漠甲抗冻蛋白基因的克隆、表达和功能检测

为了研究抗冻蛋白基因是否在新疆荒漠昆虫洛氏脊漠甲Pterocomaloczyi中存在，利用RT-PCR技术克隆获得了洛氏脊漠甲抗冻蛋白的cDNA片段，命名为Plafp743。测序结果表明洛氏脊漠甲Plafp743所编码的蛋白质由94个氨基酸组成，蛋白序列呈现规则结构CTX1X2X3X4CX5X6X7X8X9。利用原核表达载体构建重组质粒pGEX-4T-1-Plafp743，转化EscherichiacoliBL21进行融合蛋白表达，SDS-PAGE结果表明抗冻蛋白PLAFP基因以可溶性融合蛋白形式表达，相对分子质量36kD。用GlutathioneSepharose4B亲和柱对表达蛋白进行纯化后，通过赤翅甲Dendroidescanadensis抗冻蛋白的小鼠抗血清进行Westernblot分析，结果表明纯化的GST-PLAFP融合蛋白与赤翅甲抗血清能够发生特异性的免疫反应。大肠杆菌的低温抗冻保护实验结果证明，30μg/mL的GST-PLAFP在-6℃对细菌具有显著的保护作用，且随着抗冻蛋白浓度的增加，抗冻保护作用的效果也随之增加。本研究首次报道了从荒漠昆虫洛氏脊漠甲扩增得到抗冻蛋白基因，提示抗冻蛋白可能是荒漠昆虫普遍采取的过冬生存策略，为进一步开发利用昆虫抗冻蛋白奠定了基础。