rDNA介导的酿酒酵母稳定表达载体的构建

将一段含有质粒ColE1复制起始区（ori）和氨苄青霉素抗性基因（bla）的DNA片段插入到酿酒酵母rDNA片段中部的EcoRI或HpaI位点之间，在pYES2载体的基础上构建了两个rDNA介导的酿酒酵母稳定表达载体pHBM367E或pHBM367H。将黑曲霉糖化酶基因导入载体pHBM367H，获得表达载体pHBM166。为生物安全性的考虑，pHBM166经HpaI酶切去掉2.2kb的ColE1ori和bla片段后转化酿酒酵母Y33菌株，获得不含任何抗生素抗性基因的工程菌。随后，对糖化酶基因在酿酒酵母中的表达、稳定性进行了分析，结果显示，rDNA介导的糖化酶基因在酿酒酵母中的表达呈现不同的剂量效应，挑选高表达的菌株传80代之后仍能保持其产糖化酶的稳定性。