耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过DiscoveryStudio2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHaseM-TH-SBM（S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436（+））进行盐桥网络分析，发现其全局盐桥总数有所下降，但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHaseM-TH（TH）、盐桥突变酶NHaseM-TH-SB（SB）和盐桥耦合定点突变的重组酶NHaseM-TH-SBM（SBM），研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明，SBM的腈水合酶活性为543.9U·mg-1，比TH提高了31.0%；其米氏方程催化速率常数Kcat比TH提高了20%。SBM的表观失活常数KD在25～42℃范围内均明显低于对照TH，在42℃时为TH的68.0%，显示了良好的热稳定性。SBM是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。