人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证

？？？？构件pbCNCS／LF36经微注射获得转基因小鼠,同时为了准确筛选出整合的单克隆细胞,增加1个Cre／LoxP\|GFP\|Neo系统构建成pAPLM,将其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明:小鼠受体妊娠率28？5％,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀、1♂,整合率12？5％)。构件产生的3只母鼠和4号后代母鼠乳汁中重组人乳铁蛋白(hLF)用ELISA方法检测,表达量分别为3？8、2？8、0？9mg？mL？？-1？,4号后代3只母鼠表达量分别为4？2、3？9、\{3？6mg？mL？？-1？\}。构件pAPLM片段转染细胞后,经G418筛选,挑取单克隆扩大培养,其中8株PCR阳性克隆细胞荧光显微镜观察100％都有GFP的表达。以上结果证实,双启动子能调控外源基因在乳腺中特异高水平表达hLF,双标记基因可提高筛选阳性供核细胞的准确性,这为进一步作体细胞转基因克隆奠定基础。