人血管内皮生长因子功能域受体的筛选及其生物学活性研究

利用PCR技术,从人胎盘cDNA文库扩增出4个截短的人血管内皮生长因子受体(Flt-1)cDNA,分别含胞外第2,1-2,2-3,1-3个loop,应用酵母双杂交系统对Flt-1的最小配体结合域进行了研究,结果表明,不仅其胞外1-3loop能与hVEGF165结合,比其更小的片段2-3loop也具有与配体结合的能力.进一步构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3)和pPIC9K/Flt-1(2-3),转化Pichiapastoris酵母菌GS115,摇瓶培养,经1%甲醇诱导,表达的Flt-1以可溶性分子形式存在于上清中,诱导4d的表达量占上清总蛋白质的60%以上.表达产物经CM-SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS-100分子筛层析纯化,纯度达90%以上.体外生物学活性检测表明,表达的可溶性Flt-1(2-3)具有与Flt-1(1-3)接近的结合hVEGF165的能力和抑制hVEGF165对HUVEC的促增殖功能.进一步的动物模型实验证实,可溶性Flt-1(2-3)具有显著的抑制hVEGF165促进新生血管形成的功能.