噬菌体434单链阻遏蛋白高亲和力DNA配体的筛选和设计

单链阻遏蛋白RRTRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物,含有两个DBD(DNA结合结构域),一个是野生型噬菌体434的DBD-R,另一个是突变型DBD-RTRES,二者用重组接头以头接尾的方式连接起来.RTRES的α-3-螺旋中-1,1,2,5位DNA结合氨基酸分别为T,R,E,S.利用核心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的随机DNA库,体外循环筛选RTRES的DNA结合位点,将筛选到的群体克隆、测序.单链阻遏蛋白RRTRES的亲和力测定表明,最适操纵区序列含有TTAC或TTCC(上述画线部分)时,Kd值在10-12~10-11mol/L的范围.天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的Kd值在10-9mol/L数量级,与之相比,所筛选操纵区的亲和力明显提高.同时发现,亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响,特别是5′位碱基的影响.根据RTRES的识别特性,设计了共有序列为GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN(R为A或G)的单链阻遏蛋白RTRESRTRE的操纵区序列.结果表明,它们之间有特异性结合,且亲和力也很高.此方法可望用于其他DNA结合蛋白新的结合特异性的筛选.