PaenibacillusmassiliensisT7固氮基因簇nifBHDKENX的克隆、序列分析及铵和氧对nifB启动子的调控

PaenibacillusmassiliensisT7是我室从北京郊区分离的一株革兰氏阳性、产芽孢的固氮菌.根据GenBank中已发表的多种固氮生物nifH基因序列,在其保守区域设计一对简并引物,PCR扩增获得324bp的nifH片段.用地高辛标记该片段为探针,对EcoRⅠ和PstⅠ消化的P.massiliensisT7染色体DNA进行Southern杂交,结果DNA/EcoRⅠ杂交道1.1kb和9kb处,DNA/PstⅠ杂交道1.3kb和8kb处分别有两条杂交带,从而初步判断nifH可能有两个拷贝.在324bpnifH片段的基础上,采用反向PCR扩增的方法,获得了purD和nifBHDKENX基因.在nifB的上游有一个类似σ54型启动子的保守序列,在该启动子上游有一个类似激活蛋白NifA结合位点.分析表明,nifBHDKENX可能组成一个转录单元,共用nifB上游的启动子.将nifB启动子与报告基因lacZ相融合,构建成表达载体pnifB-LacZ,并转化到P.massiliensisT7中,研究铵和氧对该启动子的表达调控.结果表明,在无氧条件下,铵浓度为0%时,β-半乳糖苷酶的活性最高,随着铵浓度的增加,酶活性并没有明显的下降过程,即使铵浓度达80mmol/L时,酶活也相当于无铵时的73.12%,说明铵对nifB启动子有微弱的抑制作用,而铵浓度一定,氧浓度3%时,β-半乳糖苷酶活性最高,提高氧浓度则酶活性开始下降,当氧浓度高于20%时,β-半乳糖苷酶活性仅几个Miller单位,说明氧对nifB启动子有明显的抑制作用.