HRE.ppET-1调控血管内皮生长因子基因在内皮细胞的靶向性表达

试图探讨缺氧反应元件(hypoxia-responsiveelement,HRE)增强人前内皮素原-1基因(humanpreproendothelin-1,ppET-1)启动子在缺氧条件下靶向调控血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因在内皮细胞中的表达,以提高基因治疗的效果.构建真核表达载体pEGFP-HRE.ppET-1,pcDNA3.1-VEGF+Pa(VA),pcDNA3.1-ppET-1+VEGF+Pa(PVA),pcDNA3.1-HRE.ppET-1+VEGF+Pa(HPVA),脂质体转染离体培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)和肝细胞,荧光显微镜下观察GFP表达,验证HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中的特异性.培养基中加入100mmol/L的氯化钴模拟细胞体外缺氧环境.载体转染后,RT-PCR和Westernblot半定量分别检测各载体VEGFmRNA和蛋白水平在常氧及缺氧条件下的表达差异.应用Elisa定量检测细胞上清VEGF蛋白的表达量,分析各载体的表达水平.使用MTT实验检测细胞增殖率.GFP的表达显示HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中可有效转录外源基因,在非内皮细胞中表达极弱.RT-PCR,WesternBlot及Elisa的检测结果均表明缺氧条件下HPVA组以及PVA组中,VEGF的表达均较常氧条件下增强(P<0.05).MTT实验检测显示HPVA转染的缺氧条件下的HUVEC增殖率超过其常氧未转染对照组.结果显示,HRE.ppET-1调控元件具有内皮细胞表达特异性,并能在缺氧条件下显著提高VEGF的表达,刺激内皮细胞的增殖,为进一步开展内皮细胞的靶向基因治疗研究奠定良好基础.