Otimiza o da técnica de PCR para a detec o de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feij o Optimization of PCR technique for detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in bean seeds

O crestamento bacteriano comum, causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap), é a principal bacteriose do feijoeiro no Brasil, sendo transmitida principalmente por sementes. O presente trabalho teve como objetivo aperfei oar uma técnica, por meio de diferentes métodos de prepara o do extrato, para a detec o de Xap, bem como sua detec o simultanea com Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) nos extratos de sementes de feij o,via PCR. A partir de amostras de sementes de feij o inoculadas artificialmente com Xap e lotes comerciais, foram avaliados: extrato bruto obtido diretamente das sementes, extrato concentrado por filtra o em membrana de 0,22μM de diametro, extrato concentrado por centrifuga o e extrato plaqueado em meio semi-seletivo XCP1 com e sem antibióticos (BIO-PCR). Avaliou-se a presen a simultanea de Xap e Cff em 10 lotes comerciais de sementes de feij o através da rea o multiplex, utilizandos-se os primers X4c, X4e, CffFOR2 e CffREV4. A partir do extrato bruto, do extrato concentrado por centrifuga o e por filtragem em membrana Millipore n o foi possível a detec o de Xap nas sementes de feij o artificialmente contaminadas nem nos 47 lotes comerciais de sementes/ gr os de feij o. A técnica de BIO-PCR permitiu a detec o de Xap a partir de extratos de sementes de feij o artificialmente contaminadas e em 18 dos 47 lotes comerciais. A técnica de detec o simultanea de Xap e Cff no mesmo gel é viável, por amplificar fragmentos de DNA típicos de cada fitobactéria. O uso do meio de cultura XCP1 sem adi o de antibióticos permitiu detectar Xap com período de incuba o menor em um dia em compara o à detec o utilizando-se o meio de cultura com antibióticos Common bacterial blight, caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap), is the major bacteriosis affecting bean plants in Brazil and is mainly transmitted by seeds. This study aimed to improve a technique, using different methods of extract preparation, for the detection of Xap alone and simultaneously with Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) in bean seed extracts, via PCR. Samples of bean seeds artificially inoculated with Xap and commercial batches were used to evaluate: crude extract obtained directly from the seeds, extract concentrated by filtration in 0.22ìM-diameter membrane, extract concentrated by centrifugation and extract plated on semiselective XCP1 medium with and without antibiotics (BIO-PCR). The simultaneous presence of Xap and Cff in 10 commercial batches of bean seeds was assessed through multiplex reaction, using the primer