Optimized Expression of snake fibrinolytic enzyme Alfimeprase in Pichia pastoris and its Activity Identification
蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的优化表达及活性鉴定

alfimeprase(ALF)是蛇毒纤溶酶fibrolase的N端突变体,有纤溶活性而无出血活性。通过双酶切从克隆载体上获取目的基因alf,将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA,经高效电转化、Zeocin筛选鉴定及培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和甲醇诱导时间的优化,获得了重组ALF(rALF)高表达菌株pPICZαA-alf/GS115,且在优化条件下rALF的最高产量达425mg/L。通过His.bind柱纯化后,rALF纯度高达95%。SDS-PAGE和Western blot分析表明rALF的分子量约为24kDa,且能与一抗特异结合。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果说明rALF获得了高活性分泌表达,即确立了一种优化表达体系,为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。