腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究

分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的编码基因(treP),该酶可催化以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分解反应.反向mRNA点杂交实验表明,腾冲嗜热杆菌中treP基因在高盐胁迫条件下表达量增加,而在海藻糖诱导条件下表达量降低.将该基因导入不含TreP的大肠杆菌中进行诱导表达,SDS-PAGE表明,异源表达的TreP分子量约为90 kD,与预期值相同.通过葡萄糖氧化酶法测定分解产物葡萄糖的产率表明:TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70℃,最适pH值为7.0;通过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明:TreP催化合成反应的最适温度为70℃,最适pH值为6.0.在最适反应条件下,50μg的TreP粗酶可催化25 mmol／L α-1-磷酸葡萄糖与葡萄糖在30 min合成11.6 mmol／L 海藻糖;而同量的酶在同样时间内仅能将250 mmol／L 海藻糖分解生成1.5mmol／L 葡萄糖.以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催化海藻糖的合成反应.热稳定性实验表明,该酶性质比较稳定,在50℃下温育7 h还能保持77％以上的活性,是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶.