EGFP/SDCT1融合蛋白表达、亚细胞定位信号分析、组织分布及电生理功能研究

从正常人肾中克隆低亲和力钠离子依赖二羧酸共转运蛋白1(sodium-dependentdicarboxylateco-transporter1,SDCT1,NADC1)全长基因,并将其和N端及C端缺失突变的SDCT1基因分别插入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达载体中构建EGFP/SDCT1融合蛋白真核表达载体,然后将它们转染到人肾小管上皮细胞HKC中表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位情况以确定其定位信号.双重PCR分析证实融合基因已整合到细胞基因组中,Westernblot显示融合基因已在细胞中得到表达.共聚焦显微镜分析显示正常人SDCT1蛋白主要定位于细胞膜上,与生物信息学的预测结果一致,而C端缺失的SDCT1基因转染的细胞,其绿色荧光位于细胞质,N端缺失基因转染的细胞,其绿色荧光主要位于细胞膜上.将体外转录的融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达并用双电极电压钳技术记录细胞跨膜电流,结果在卵细胞膜上测定出了Na+内向电流.免疫组化结果显示SDCT1主要表达于人近端肾小管上皮细胞的管腔侧,而在远端肾小管、集合管、肾间质和肾小球中未见SDCT1的表达.上述研究表明,正常人SDCT1蛋白定位于近端肾小管上皮细胞的管腔侧膜上,SDCT1蛋白的C端部分对于其合成后的迁移及靶向定位是必需的,人SDCT1蛋白的细胞膜定位序列可能位于其C端部分.