多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库的 构建和鉴定

为了克隆和转化多枝赖草(Leymus multicaulis)的耐黄矮病、耐蚜虫、耐干旱、耐盐碱等抗逆性基因,利用脉冲电泳分离纯化2Mb以上核DNA,酶切后回收10～200kb DNA片段按大小分5组与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B,在卡那霉素和蔗糖选择压下均有阳性克隆.用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H/sacB分别构建了文库Ⅰ和Ⅱ,约16.5和23.6万个克隆,估计覆盖3～5倍多枝赖草基因组大小.文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中,每孔1.2mL菌液中含300～600个克隆,40多万个克隆转存到3块384孔板,留24个孔存叶绿体和线粒体DNA探针菌液,可用于后续文库鉴定.此外,从文库Ⅰ和Ⅱ分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中.17块384孔板都用GeneTACTMG3复制了2份,点高密度杂交膜6张,以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5′RACE-GR和3'RACE-GR为探针初步筛选到19个阳性克隆.两文库为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。