黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp. GN14 的α-半乳糖苷酶基因克隆、表达与酶学特性

摘要:【目的】克隆高原唯一珍惜鹤类———黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp. GN14 的α-半乳糖苷酶基因agaAGN14，并对该酶进行序列分析、系统发育分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】利用简并PCR 和GCTAIL-PCR 方法获得agaAGN14 全长，并对其氨基酸序列(AgaAGN14) 进行比对和neighbor-joining系统发育树的构建。将agaAGN14 重组到载体pET-28a(+)中并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达。利用组氨酸标签纯化重组α-半乳糖苷酶rAgaAGN14 并进行酶学性质分析。【结果】agaAGN14 全长2109 bp，GC 含量66.8%，编码702个氨基酸(77.5 kDa)。AgaAGN14 与数据库中序列的最高一致性为53.7%，与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶的一致性＜43%。系统发育分析将AgaAGN14 聚于具有催化域KWD和SDXXDXXXR 的α-半乳糖苷酶分支，与土壤微生物来源α-半乳糖苷酶距离相对较近，而与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶距离相对较远。rAgaAGN14 可水解pNPG、棉籽糖、密二糖、水苏糖、菜粕和棉籽粕，表观最适pH为6.5，在pH6.0－pH 9.0的范围内稳定并维持50%以上的酶活性。rAgaAGN14 的表观最适温度为45℃，在10℃、20℃ 和37℃内稳定并分别具有约28%、30%和80%的酶活。在45℃pH6.5条件下，rAgaAGN14 对pNPG的Km、Vmax和kcat分别为0.41mmol/L、18.28μmol/min/mg和25.36s－1。rAgaAGN14受Ag+、Hg2+及SDS抑制，受K+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Cu2+和β-mercaptoethanol部分抑制，受Co2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Na+和EDTA 的影响较小。【结论】首次报道从黑颈鹤粪便中分离到Arthrobacter 菌，并对该属细菌α-半乳糖苷酶进行序列分析、系统发育分析、异源表达和重组酶的酶学特性分析。rAgaAGN14 序列较新颖，其酶学特性可能是同时适应黑颈鹤肠道环境和高原淡水湿地环境的结果。