Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) for the screening for genes involved in laccase glucose repression in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans
利用根癌农杆菌T-DNA 插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因

摘要:【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌，主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏，机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation，ATMT)建立一个容量约200000 的随即插入突变文库，在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern 确定突变株中T-DNA 的拷贝数，利用反向PCR 获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30 株葡萄糖去阻遏突变株，Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA 拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10 个不同生物学功能基因，如参与碳水化合物的代谢，固醇的合成，几丁质的合成，GPI 脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT 突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因，为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆 酶活性提供参考。