Heterologous expression and characterization of Yarrowia lipolytica lipase 4 and lipase 5 in Pichia pastoris
解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质

摘要:【目的】克隆解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica) 脂肪酶LIP4 和LIP5 的cDNA 序列，研究其基因结构，并实现其在毕赤酵母中的功能表达，以探讨其酶学性质。【方法】利用反转录PCR 首次扩增LIP4 和LIP5 的编码基因，用SignalP 3. 0 分析其基因序列，然后分别构建胞内表达载体pPIC3. 5K-Lip4、pPIC3. 5K-Lip5 和胞外表达载体pPIC9K-Lip4、pPIC9K-Lip5，将其转入毕赤酵母GS115 中表达，以NTA 树脂纯化酶蛋白，研究其酶学性质。【结果】cDNA 序列测序结果显示两者均不含内含子，酶蛋白的氨基酸序列中含有典型脂肪酶的活性三联体结构和五肽保守区;酶学性质研究表明，两者的最适底物均为癸酸(C8) 对硝基苯酚酯，最适pH为7. 0，最适温度为40℃，但LIP4 对pH 和温度更敏感;两者均能被Ca2 + 激活，且LIP5 还能为Mg2 + 激活，但均被Hg2 + 、乙二胺四乙酸(EDTA) 和苯甲基磺酰氟( PMSF) 强烈抑制。【结论】首次克隆了解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4 和LIP5 编码基因，实现了其在毕赤酵母中的活性表达，并初步研究了其酶学性质，为上述脂肪酶的应用及进一步深入研究解脂耶氏酵母脂肪酶家族奠定了基础。