Construction of Recombinant Adenovirus Including Microdystrophin and Expression in the Mesenchymal Cells of mdx Mice
Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒，来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰，为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒，获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV，获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO，去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用脂质体介导转染293细胞，通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞，通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒，病毒滴度为5.58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。