Cloning of the gene encoding α-glucosidase from Aspergillus niger and its expression in Pichia pastoris
黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71为宿主菌表达黑曲霉（Aspergillus niger）SG136 α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）。【方法】以实验室保藏的A. niger SG136总DNA为模板，根据NCBI 数据库中A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶的cDNA序列（aglu）设计引物，通过PCR和重叠延伸PCR（overlap-PCR）方法，扩增得到aglu，将其克隆到载体pMD18-T simple vector，测序结果表明，aglu编码960个氨基酸。与A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶相比仅有一个氨基酸的差异。将得到的aglu亚克隆到质粒pPIC9K，构建表达载体pPIC9K-aglu，经Bgl Ⅱ线性化后电转化P. pastoris KM71，经过MD、YPD/G418平板筛选表型，PCR方法验证，获得分泌表达重组P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶培养中通过添加终浓度为1 %的甲醇诱导α-葡萄糖苷酶的分泌。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为98 kDa和33 kDa，阴性对照中没有出现此条带，非变性电泳检验为一条带。制备的粗酶液的酶学性质表明，转苷反应最适pH为5，最适温度为55 ℃。在最适pH和温度下，反应24 h时低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0 %。【结论】黑曲霉α-葡萄糖苷酶在P. pastoris中获得可溶性表达，并证明有一定的转糖苷活性。