Construction the Recombinant Human Estrogen Receptor (hER)Gene Yeast Using Two-Hybrid Yeast Technique
酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类,抗雌激素化合物和环境样品的类,抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER GRIP1和ER SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER GRIP1和ER SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER GRIPl和ER SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7.mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.