Preparation and identification of recombinant adenoviruses carrying short hairpin RNA targeting parathyroid hormone related protein of goat
山羊PTHrP基因干扰重组腺病毒的制备与鉴定

甲状旁腺激素相关蛋白 (Parathyroid hormone related protein，PTHrP) 具有广泛生物学功能，对调控钙代谢具有重要作用。采用RNA干扰和重组腺病毒技术，对山羊乳腺上皮细胞中PTHrP基因表达进行沉默，为进一步研究该基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定基础。采用BLOCK-iT shRNA腺病毒干扰系统，将设计好的寡聚shRNA-322/357经退火复性后插入穿梭质粒pENTR/CMV-GFP/U6中。经Western blotting检测干扰效率后，选择pENTR/CMV-GFP/U6-322与病毒骨架质粒pAd/PL-DEST进行同源重组，成功获得重组干扰腺病毒载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-322，并转染HEK-293细胞，通过包装、扩增后产生干扰重组腺病毒AD-PTHrP-322，TCID50法测定其滴度为2.0×109 PFU/mL。用AD-PTHrP-322感染山羊原代乳腺上皮细胞(MOI=200)，经实时定量PCR及Western blotting检测表明在病毒感染24 h、48 h和72 h后，山羊乳腺上皮细胞中PTHrP mRNA表达量分别下调了29.2％、68.1％和82.6％ (P＜0.05)，其蛋白表达水平也明显下调，干扰效果明显。