凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现，在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向，妨碍与引物结合，从而难以合成突变的DNA，采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达，除C206A外，约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明，Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的，但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响，在5个突变体中，C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍，而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同，其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变，而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活，说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象，而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。