紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料，制备总DNA，经EcoRⅠ限制酶部分酶解，通过10—50％蔗糖梯度离心，分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒，构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交，从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体，通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配，在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物，通过植物结瘤试验，分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切，得到25kb左右的外源DNA片段，该片段携带完整的结瘤基因簇。