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Bacillus pumilus WL-11木聚糖酶A的纯化、鉴定及其底物降解方式
许正宏,陶文沂
生物工程学报 , 2005,
Abstract: 对一株Bacilluspumilus WL_11木聚糖酶的纯化、酶学性质及其底物降解模式进行了研究。经过硫酸铵盐析、CM_Sephadex及SephadexG_75层析分离纯化,获得一种纯化的WL_11木聚糖酶A ,其分子量为26.0kD ,pI值9.5 ,以燕麦木聚糖为底物时的表观Km 值为16.6mg mL ,Vmax值为12.63μmol (min·mg)。木聚糖酶A的pH稳定范围为6 0至10 4 ,最适作用pH范围则在7.2至8.0之间,是耐碱性木聚糖酶;最适作用温度为45℃～55℃,在37℃、45℃以下时该酶热稳定性均较好;50℃保温时,该酶活力的半衰期大约为2h ,在超过50℃的环境下,该酶的热稳定较差,55℃和60℃时的酶活半衰期分别为35min和15min。WL_11木聚糖酶A对来源于燕麦、桦木和榉木的可溶性木聚糖的酶解结果发现,木聚糖酶A对几种不同来源的木聚糖的降解过程并不一致。采用HPLC法分析上述底物的降解产物生成过程发现木聚糖酶A为内切型木聚糖酶,不同底物的降解产物中都无单糖的积累,且三糖的积累量都较高;与禾本科的燕麦木聚糖底物降解不同的是,木聚糖酶A对硬木木聚糖降解形成的五糖的继续降解能力较强。采用TLC法分析了WL-11粗木聚糖酶降解燕麦木聚糖的过程，结果表明燕麦木聚糖能够被WL-11粗木聚糖酶降解生成系列木寡糖，未检出木糖，这说明WL-11主要合成内切型木聚糖酶A，同时发酵液中不含木糖苷酶，适合用来酶法制备低聚木糖。
产3-羟基丙酸重组大肠杆菌JM109的构建及发酵条件优化
张晓梅,李新生,许正宏
生物技术通报 , 2013,
Abstract: 将编码乙醛脱氢酶编码基因aldh连接重组质粒pEtac-dhaB,转化大肠杆菌,得到产3-羟基丙酸(3-HP)重组大肠杆菌JM109(pEtac-dhaB-aldh),并将响应面法应用于重组大肠杆菌JM109(pEtac-dhaB-aldh)发酵条件优化。单因素发酵试验结果表明,影响3-HP产量的4个主要因子是初始甘油浓度,酵母膏浓度,维生素B12浓度以及KH2PO4浓度,应用响应面分析法对各因素的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨。优化后培养基组成(g/L):甘油62g/L、VB120.05g/L、KH2PO47.4g/L及酵母膏6.2g/L,在此培养基中3-HP的产量为5.8g/L。
bacilluspumiluswl-11木聚糖酶a的纯化、鉴定及其底物降解方式
许正宏, 陶文沂？？*
生物工程学报 , 2005,
Abstract: 对一株bacilluspumiluswl_11木聚糖酶的纯化、酶学性质及其底物降解模式进行了研究。经过硫酸铵盐析、cm_sephadex及sephadexg_75层析分离纯化,获得一种纯化的wl_11木聚糖酶a,其分子量为26.0kd,pi值9.5,以燕麦木聚糖为底物时的表观km值为16.6mgml,vmax值为12.63μmol(min·mg)。木聚糖酶a的ph稳定范围为60至104,最适作用ph范围则在7.2至8.0之间,是耐碱性木聚糖酶;最适作用温度为45℃～55℃,在37℃、45℃以下时该酶热稳定性均较好;50℃保温时,该酶活力的半衰期大约为2h,在超过50℃的环境下,该酶的热稳定较差,55℃和60℃时的酶活半衰期分别为35min和15min。wl_11木聚糖酶a对来源于燕麦、桦木和榉木的可溶性木聚糖的酶解结果发现,木聚糖酶a对几种不同来源的木聚糖的降解过程并不一致。采用hplc法分析上述底物的降解产物生成过程发现木聚糖酶a为内切型木聚糖酶,不同底物的降解产物中都无单糖的积累,且三糖的积累量都较高;与禾本科的燕麦木聚糖底物降解不同的是,木聚糖酶a对硬木木聚糖降解形成的五糖的继续降解能力较强。采用tlc法分析了wl-11粗木聚糖酶降解燕麦木聚糖的过程，结果表明燕麦木聚糖能够被wl-11粗木聚糖酶降解生成系列木寡糖，未检出木糖，这说明wl-11主要合成内切型木聚糖酶a，同时发酵液中不含木糖苷酶，适合用来酶法制备低聚木糖。
谷氨酸棒杆菌syps-062合成l-丝氨酸的代谢通量分析
张晓梅？,窦文芳？,许泓瑜？,许正宏？
生物工程学报 , 2010,
Abstract: 以一株由自然界筛选获得的能够利用糖质原料直接产l-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌corynebacteriumglutamicumsyps-062为研究对象，考察了一碳单元循环中的辅因子—叶酸和维生素b12对菌株生长、蔗糖消耗及l-丝氨酸生成的影响，同时对处于对数生长期的菌株进行了代谢流量分析。结果发现，添加扰动因子叶酸和维生素b12对磷酸戊糖途径(hmp)碳流影响较大，碳源主要用于细胞生长及合成能量，而流向目的产物l-丝氨酸的碳流减少。同时在添加维生素b12时，增大了g3p节点的l-丝氨酸合成途径的分流比，但造成三羧酸循环(tca)的流量不足，需要大量回补，从而限制了产物合成速率的进一步提高。
一株产脂肪酶嗜盐菌的鉴定及耐盐机理
张晓梅,窦文芳,许泓瑜,许正宏
应用与环境生物学报 , 2010, DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00100
Abstract: 从采自内蒙古锡林浩特地区盐湖的样品中筛选到产脂肪酶嗜盐菌jnph-3，该菌株可在含有1.5~5mol/lnacl的培养基上生长，最适生长温度45℃，最适ph7~9.5.经形态学分析、生理生化实验及16srdna鉴定，jnph-3菌株为halorubrumaidingense，属于极端嗜盐菌.jnph-3菌株在生长过程中专一性依赖na+，对cl-依赖性较小，k+浓度变化对菌体生长无明显影响.高效液相色谱分析表明，jnph-3菌株在液体复合培养基中能够产生四氢嘧啶，且与环境中盐浓度呈负相关，说明jnph-3体内除存在产生四氢嘧啶的机制来维持渗透平衡，还有其它机制来维持细胞正常生长.图3表3参14
直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析
林琳,窦文芳,张晓梅,许泓瑜,许正宏,王正祥
生物技术通报 , 2008,
Abstract: 以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)SYPS-062glyA基因为研究对象,比较C.glutamicumSYPS-062与C.glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以SYPS-062及ATCC13032基因组为模板,利用PCR技术获得丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA。核苷酸序列分析结果表明,来源于SYPS-062和ATCC13032的glyA基因片段全长均为1305bp,编码434个氨基酸,分子量为46.5kD,基因的同源性为99.54%,存在6个核苷酸的差异,引起一个氨基酸残基的突变。将获得的基因分别在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中诱导表达。酶活测定结果显示,2种不同菌株来源的重组SHMT的比活力稍有差异,说明SYPS-062glyA基因的差异对其表达产物SHMT蛋白构型及功能影响不大。提示对于C.glutamicumSYPS-062能够利用糖质原料产L-丝氨酸的机制解析应进一步从glyA基因的转录水平、翻译水平及胞内SHMT辅酶的供给情况等方面进行深入研究探讨。
提高重组毕赤酵母表达hIFNb-HSA的碳源控制策略
张宏斌,窦文芳,许泓瑜,金坚,李华钟,许正宏
过程工程学报 , 2007,
Abstract: 研究了重组毕赤酵母KM71/IH菌体生长阶段饥饿培养对其细胞相对活性及人b干扰素-血清白蛋白融合蛋白(hIFNb-HSA)表达的影响.结果表明，在以甘油为唯一碳源的细胞培养后期进行饥饿培养以耗尽培养基中的甘油会导致重组细胞相对活性的降低，进而减少hIFNb-HSA的表达量.在此基础上，提出了菌体培养后期，即过渡阶段流加甘露醇碳源代替饥饿培养的策略，不仅可以消除培养液中甘油残留对甲醇诱导表达hIFNb-HSA的不利影响，而且能够保持重组细胞培养物较高的相对活性(>97%)，从而可以提高甲醇诱导表达hIFNb-HSA的水平，表达量可达37.3mg/L，最大生产强度为0.78mg/(L×h)，较对照分别提高了92.3%和44.4%.
湖北省丘陵山区风能资源特征分析
许,杨,杨宏青,陈正洪,成,驰
长江流域资源与环境 , 2014, DOI: 10.11870/cjlyzyyhj201407007
Abstract: 利用分布在湖北省丘陵山区的12个70m（80m）高测风塔一整年的资料，对我省丘陵山区风能资源的若干特征进行了较为详尽的对比分析，找出其中普遍的规律。结果表明：（1）我省山区风速季节变化为春季大，夏季和秋季较小；风速日变化为夜间大白天小，且变化幅度相对较大的测风塔主要分布在低山和中山区域；（2）有效风速频率在79%～92%，破坏性风速出现少；（3）风向频率较为集中，主要分布在偏南和偏北两个相反的方位；（4）风速随高度变化较复杂，10～30m高度风速增加幅度较大，部分地区30～80m高度存在等风层或风速随高度减小的情况；（5）有效风速段、大风及主导风向下的湍流强度均为中等。研究成果对湖北省，甚至是南方山区风能资源的合理开发利用将有所裨益
谷氨酸棒杆菌argb基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的初步研究
陈雪岚,许正宏,陶文沂
食品科学 , 2005,
Abstract: ？根据genbank报道的谷氨酸棒杆菌atcc13032序列,设计并合成一对引物,利用温度梯度pcr仪,获得了argb基因全长。将其克隆到pgem-t-easy载体中,经测序鉴定后定向克隆至表达载体pgex-4t-1中,构建了pgex-argb表达质粒。
钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶分析
陈雪岚,许正宏,陶文沂
食品科学 , 2005,
Abstract: ？？采用亲和层析和sds-page方法分析钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶。实验表明此菌产精氨酸关键酶之一是乙酰谷氨酸激酶,其分子量为34kd;同时另一分子量为49kd的蛋白质亦对精氨酸有较高的亲和性,揭示钝齿棒杆菌产精氨酸的代谢途径中受精氨酸抑制的酶不是唯一的。实验对限速酶之一——乙酰谷氨酸激酶的酶学性质做了初步研究,结果显示,此酶的最适反应温度为49℃,最适ph为8.0;金属离子pb2+、cu2+、mn2+和fe2+对乙酰谷氨酸激酶有强烈的抑制作用;dtt对该酶的活力有一定的影响。
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