双孢蘑菇酪氨酸酶基因在酿酒酵母中的异源表达及其酶学特性

[目的]在酿酒酵母中异源表达双孢蘑菇来源的酪氨酸酶基因PPO2，并研究酪氨酸酶在酿酒酵母胞内及胞外的酶学特性。[方法]提取双孢蘑菇总RNA，通过RT-PCR克隆酪氨酸酶基因PPO2，构建表达载体pSP-G1-PPO2，并转化至酿酒酵母进行表达，采用镍亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。[结果]在酿酒酵母中正确表达了大小为65 kDa的酪氨酸酶蛋白。重组酶能催化底物酪氨酸产生黑色素。体外活性测定表明，酪氨酸酶催化最适温度为45 ，以酪氨酸和多巴为底物时最适pH分别为7.0和8.0。在酿酒酵母中测得底物酪氨酸浓度低于2.5 mg/mL时，黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性。[结论]来源于双孢蘑菇的酪氨酸酶基因PPO2在酿酒酵母中成功表达，重组酶具有良好的酶学特性。利用酪氨酸酶产物黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性这一特性，可将其作为细胞酪氨酸产量的传感器，为高通量筛选酪氨酸高产菌株提供了思路