Akt1基因转染对BMSCs缺氧耐受影响的实验研究

目的探讨重组慢病毒（lentivirus，LVs）介导Akt1基因转染大鼠BMSCs能否提高细胞缺氧耐受能力，为提高干细胞移植治疗心肌梗死效果提供理论依据。 方法以LVs作为转染载体，增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）为标记，构建携带Akt1基因的pLVX-EGFP-3FLAG病毒载体。取第3代3～5周龄SD大鼠BMSCs分别转染pLVX-EGFP空白病毒液（B组）和pLVX-EGFP-3FLAG病毒液（C组），以未转染病毒的BMSCs为空白对照组（A组）。转染后2～3 d荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况，并于48 h时采用Western blot法检测B、C组Akt1蛋白表达情况。将B、C组培养的BMSCs分别置于94% N2、1% O2和5% CO2缺氧箱进行缺氧干预（分别为B1、C1组），取B1、C1组缺氧干预0、3、6、9、12 h的细胞以膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶双染法行流式细胞仪分析细胞凋亡率和死亡率、MTT法分析细胞增殖情况、Western blot法检测凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表达情况。 结果转染后A组荧光显微镜下未见绿色荧光表达，B、C组可见明显绿色荧光，转染效率约60%；Western blot可检测到B、C组Akt1表达，且C组Akt1表达明显高于B组（t=17.525，P=0.013）。B1组缺氧干预后各时间点细胞凋亡率和死亡率均逐渐增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；C1组细胞凋亡率和死亡率在缺氧干预后3 h短暂下降，之后逐渐增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。除0 h外，缺氧干预各时间点C1组细胞凋亡率和死亡率均显著低于B1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。MTT法检测示，常氧条件下B、C组各时间点吸光度（A）值均显著高于缺氧条件下B1、C1组（P＜0.05），C组各时间点A值均显著高于B组（P＜0.05），缺氧干预后6、9、12 h B1组A值显著低于C1组（P＜0.05）。Western blot法检测示，与B1组比较，C1组缺氧干预各时间点Caspase-3表达均显著下调（P＜0.05）。 结论通过重组LVs介导Akt1基因转染可通过抑制凋亡显著提高BMSCs的缺氧耐受能力，从而为改善干细胞移植治疗心肌梗死效果提供新思路