大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定

摘要 旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建sFcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠sFcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠sFcγRIIb基因,构建原核表达载体sFcγRIIb-pET17b,转化大肠杆菌BL21（DE3）。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对sFcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白sFcγRIIb可被特异性抗体所识别且与IgG具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白