改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码小RNA 的应用初探

摘要 旨在构建一种能快速、有效检测不同细胞中差异表达的非编码小RNA 的方法。以乳腺癌细胞株MCF7 和非癌乳腺上皮细胞HBL100 为材料，用RNA 分离试剂盒分离获得长度为18-100 nt 的RNA 片段，3' 端添加poly（A）尾后利用smart 技术进行反转录，在反转录体系中加入生物素标记的dATP，得到单链cDNA ；结合生物素- 磁珠分离技术将cDNA 与待测RNA 进行消减杂交并以U6 为内参验证消减结果；最后利用巢式PCR 扩增杂交产物，PCR 产物插入T 载体后，挑取阳性克隆进行测序。结果显示，总RNA 按不同大小片段分离富集后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，于100 nt 以下显示较亮条带；以U6 为内参检测杂交效率，杂交后U6 于33 个循环时可见少量扩增条带；杂交产物经巢式PCR 和电泳表明在100 nt 范围内有明显条带，得到差异表达的非编码小RNA。经过改良的消减杂交方法可以快速、有效的检测不同标本中差异表达的非编码小RNA