多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3 种食源性致病菌

建立可同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法。根据单增李斯特菌inlA基因、鼠伤寒沙门氏菌invA基因、大肠杆菌O157:H7的wzy基因设计3 对特异性引物。对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2＋浓度、dNTP浓度进行了优化，并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件。结果表明：25 μL反应体系，10×PCR buffer为2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）为3.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）为2 μL，inlA基因上下游引物（5 μmol/L）为1 μL，invA基因上下游引物（5 μmol/L）为1 μL，wzy基因上下游引物（5 μmol/L）为2 μL，单增李斯特菌DNA模板为1 μL，鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1 μL，大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1 μL，exTaq DNA聚合酶（5 U/L）为0.3 μL，加ddH2O补足25 μL。反应条件为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，53.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 个循环；72 ℃延伸10 min。鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g，大肠杆菌O157:H7 3.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。该技术可为快速检测鲜切哈密瓜中病原菌污染度及其控制提供参考依据