balb/c鼠冷诱导rna结合蛋白的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

为了获得冷诱导rna结合蛋白（cirp）的单克隆抗体，本通过rt-pcr方法从冷处理balb/c小鼠睾丸的总rna中扩增获得cirp基因序列，克隆至pgem-t载体，获得重组质粒pgem-cirp，并进行序列测定。将测序正确的cirp序列插入质粒pqe-30-xa，构建表达载体pqe-30-cirp并转化e.colim15，iptg诱导后sds-page分析表明cirp基因在大肠杆菌中获得高效表达，可溶性分析表明cirp融合蛋白以包涵体形式表达。采用ni-nta亲和层析、电洗脱纯化融合蛋白cirp，将纯化的蛋白免疫balb/c小鼠，三次免疫后，间接elisa测定小鼠效价，效价为1:105，采用杂交瘤技术融合，用间接elisa法、有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞，通过westernblot对mcab特异性进行鉴定，利用间接elisa方法对mcab的ig亚类(型)、杂交瘤细胞上清、腹水效价进行测定。结果获得了1a6、2d3、3c5及4c44株稳定分泌cirpmcab的杂交瘤细胞株，1a6、3c5、4c4产生的单克隆抗体亚类均为igg2b，2d3产生的单抗亚类为igg3，轻链均属κ链。4株单克隆细胞上清效价均在1:103以上，腹水效价均达1:107以上。western-blot分析4株单抗均能与重组蛋白cirp特异性结合，与空载体对照没有反应。以3c5细胞株的腹水为一抗，检测冷应激小鼠多种组织中天然cirp蛋白表达，结果显示3c5细胞腹水能识别心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等多种组织中天然cirp，并与能之与结合。这证明该抗体具有良好特异性和结合活性，制备的单克隆抗体可以用于深入开展cirp的功能性和应用性研究。