插入单个loxp位点的伪狂犬病病毒上海株tk基因缺失株的构建

根据genbank已发表的pegfp－c1序列，设计并合成两对引物，pcr扩增出两端各含一loxp位点的gfp表达盒gfp-loxp。克隆于转移载体psklr获得psklr-gfp-loxp。基于同源重组原理,psklr-gfp-loxp与prvsh株基因组dna共转染293t细胞，在brdu的筛选压力下，利用蚀斑法在tk-143细胞上筛选出表达gfp的tk基因缺失的重组毒株rprv1。将表达cre酶的质粒载体ppog231与rprv1基因组dna共转染293t细胞，在cre酶的作用下去除gfp表达盒以及一个loxp位点，筛选得到含单个loxp位点的重组病毒株rprv2。pcr扩增证实所获得的重组病毒tk缺失270bp，只有一个34bp的loxp位点，并且能在rk-13细胞上稳定传代。ld50试验表明rprv2的毒力下降。