质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响

？背景与目的：探讨影响嵌套缺失反应的重要因素，找出相应的解决方案。材料与方法：以构建好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin,ngal)基因5’端调控区质粒pglb-g6为研究对象,采用碱裂解法、聚二乙醇纯化法及qiagen试剂盒等3种不同方法制备该质粒，分别研究exoⅲ对它们进行非特异性切割的敏感性，选出对exoⅲ不敏感的质粒制备方法；在22℃和37℃分别进行缺失反应，琼脂糖凝胶电泳监控，以确定缺失反应是否已经发生；应用pcr技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子。结果：qiagen试剂盒制备的质粒对exoⅲ的非特异性切割最不敏感，可用于进行下一步的缺失反应；在22℃进行缺失反应时，电泳鉴定发现dna片段的长度没有明显的变短，而在37℃时，同一反应体系的dna片段长度明显缩短；进一步用限制性内切酶酶切可筛除pcr中的假阳性，获得准确的缺失子。结论：质粒的质量是确保进行特异性缺失反应的关键因素，通过qiagen试剂盒制备的质粒质量较好；设立一个37℃缺失对照管可作为判断低温条件下是否发生缺失的标准；pcr技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子，可确保获得特异的缺失子。