可条件性诱导plk1稳定敲降的食管癌细胞株的建立

？目的：建立可条件性诱导plk1-shrna稳定表达的食管癌细胞株，为深入研究plk1在食管癌发生发展中的作用及分子机制提供细胞模型。方法：合成plk1-shrna寡核苷酸，退火后连接到慢病毒表达载体plko-tet-on并转化至感受态细胞stbl3，利用菌落pcr和测序分析鉴定阳性重组子。用plko-shplk1-tet-on重组质粒和包装质粒共转染293t细胞，收集病毒上清，感染食管癌细胞kyse510，利用嘌呤霉素筛选可诱导plk1-shrna稳定表达的细胞株。采用qrt-pcr和westernblot检测强力霉素(dox)诱导plk1-shrna表达的效率。结果：菌落pcr和测序分析结果显示，plko-shplk1-tet-on重组质粒中plk1-shrna的序列及插入位点正确。包装、收获病毒并感染kyse510细胞后，筛选获得了具有嘌呤霉素抗性的稳定细胞株kyse510-shplk1-tet-on。qrt-pcr和westernblot的检测结果显示，0.1μg/mldox即可显著下调kyse510-shplk1-tet-on细胞中plk1的表达。结论：成功构建了诱导型plk1-shrna慢病毒表达载体，并筛选获得了可条件性诱导plk1稳定敲降的食管癌细胞株，为进一步探讨plk1异常表达与食管癌发生发展的关系提供了理想的细胞模型。