细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带his标记的增强型绿色荧光蛋白(egfp)表达载体pet14b-he(pet14b-his-egfp)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(cpp)、连接子、核定位信号(nls)序列和egfp的融合蛋白表达载体pet14b-hc(l)ne(pet14b-his-cpp-linker-nls-egfp);经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化bl21(de3)宿主菌,经异丙基硫代-β-d-半乳糖苷诱导表达后、用ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中,荧光显微镜下观察并进行westernblot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果酶切、测序证实载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核,并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体,建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统,为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。