小鼠b淋巴瘤a20细胞株mcd99l2基因表达检测及真核表达载体构建

目的检测及克隆小鼠b淋巴瘤a20细胞株mcd99l2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测a20细胞中mcd99l2基因的mrna表达,rt-pcr法从a20细胞总rna中获取mcd99l2基因含编码区全长cdna,克隆入t载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的pcr引物,pcr获取含mcd99l2基因编码区片段,用限制性内切酶ecori和xhoi双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与pcdna3．1／mychisc(+)质粒重组,对产生的重组子进行pcr、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测a20细胞中mcd99l2基因mrna呈阳性表达;rt-pcr法成功获得mcd99l2基因编码区全长cdna序列,dna序列测序结果与genbank提供的已知序列(nm-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcdna3．1-mcd99l2中的插入片段经dna测序后与genbank中md99l2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠b淋巴瘤a20细胞株存在mcd99l2基因,采用rt-pcr和t-a技术克隆了a20细胞的mcd99l2基因,成功构建了pcdna3．1-mcd99l2真核表达载体,为下一步探索mcd99l2基因在小鼠b淋巴瘤a20细胞株中的功能奠定了实验基础。