华南hcv1b亚型ns5a插入式复制子重组质粒的构建和序列分析

摘要：目的构建来自华南不同慢性丙型肝炎（chc）患者的hcvns5a的复制子重组质粒并测序分析，探索hcvns5a在抗病毒应答中生物学特性。方法以能够高效复制的1b型hcv复制子质粒为骨架，构成带有miuⅰ和bclⅰ双酶切位点的开关质粒，采用逆转录-聚合酶链反应从不同chc患者血清中扩增获得hcv1b亚型ns5a全长片段，克隆到pmd-18载体中，测序分析其中的pkrbd、isdr、v3和irrdr区域的变异情况。扩增产物中无miuⅰ和bclⅰ酶切序列的，在引物中引入相关酶切序列后再扩增，双酶切后将ns5a区段置换入hcv1b复制子骨架中。结果成功扩增出ns5a全长片段并克隆测序，将ns5a区isdr-v3区域置换入复制子中，测序结果正确。序列比对显示应答株的isdr和pkrbd氨基酸变异数目比无应答株高；v3和irrdr区域存在较高氨基酸突变率。结论成功构建包含华南hcv1b亚型ns5a核心区域的复制子插入式重组质粒，为研究hcvns5a生物学特性、干扰素抵抗的机制以及难治性chc患者的个体化抗病毒治疗分析奠定了基础。