桑天牛内切β-1，4-葡聚糖酶活性分析及其基因cds区的克隆与表达

【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因，为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠(cmcna)测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性，trizol法提取桑天牛肠道总mrna，扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因，用dnastar和ncbi上的blast进行序列分析。根据测序得到的基因序列设计1对引物，扩增桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因cds区，构建原核表达载体pet-apeg，并在大肠杆菌中表达。【结果】桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶最适ph为4.4～5.6，ph值为5.0时酶活性最高；最适温度为30～50℃，50℃时酶活最高；酶液在37℃稳定性好，而在60℃的水浴中处理30min，酶活性急剧下降。桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因cds区长度为978bp，编码325个氨基酸残基；blast结果显示，该基因序列与黄星天牛属于ghf5的纤维素酶基因序列相似性达85%，氨基酸序列相似性达90%，与已报道的桑天牛ag-easeⅲ的序列相似性达98%，氨基酸序列相似性达99%；构建原核表达载体pet-apeg在大肠杆菌bl21(de3)中进行表达，sds-page检测结果表明，诱导表达沉淀在约55ku处有1条特异蛋白条带，与预测蛋白的分子量相符。【结论】陕南地区桑天牛β-1,4-葡聚糖酶为内切葡聚糖酶，属于ghf5家族，其可以在大肠杆菌中表达。