猪jiv90基因打靶载体的构建与细胞转染试验

【目的】构建猪jiv90基因的同源打靶载体，并转染猪血管内皮细胞系(suvec)，对jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据ncbi中公布的jiv90基因序列，克隆得到jiv90基因核心区两侧的基因序列，并以此为长短臂，构建了可定点敲除jiv90基因的打靶载体。用该载体转染suvec，通过新霉素(g418)和丙氧鸟苷(ganc)的筛选得到稳定的细胞株，再利用pcr检测neo基因在细胞基因组上的整合情况，最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(csfv)感染试验，并用实时定量pcr(real-timepcr)检测csfv的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的suvec全基因组dna为模板，克隆得到了针对jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列，基因片段长度分别为4522bp和1944bp。将长短臂与打靶骨架载体pa2t相连后，构建了关于猪jiv90基因的同源打靶载体jks。用jks载体转染suvec，通过1500μg/mlg418和200nmol/mlganc正负筛选，得到了稳定转染jks载体的suvec。对于稳定筛选后的试验组细胞，感染csfv并进行real-timepcr，结果表明，正常细胞中的csfv核酸含量是转染jks载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪jiv90基因的同源长短臂，并构建了猪jiv90基因的打靶载体jks，敲除jiv90基因细胞中的csfv核酸片段含量显著降低，说明jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。