梅花鹿igf-1的原核表达与纯化

【目的】克隆梅花鹿（cervusnippon）胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowthfactor1，igf-1）的成熟肽基因，并对其进行原核表达及纯化，以获得具有生物学活性的蛋白，为研究igf-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以genbank中的梅花鹿igf-1基因序列（登录号：hq890468）设计1对引物，以构建的梅花鹿pmd-18t-igf-1重组质粒为模板，克隆igf-1成熟肽的基因序列，构建重组质粒pmd-igf-1，将其插入pet-32a表达载体后，构建pet-32a-igf-1质粒，鉴定后，将pet-32a-igf-1转入rosetta大肠杆菌进行诱导表达（0.6mmol/liptg，37℃，4h）后，对其表达产物进行sdspage和westernblotting检测。用ni-agarose柱亲和层析试剂盒分离、羟胺裂解纯化目标蛋白，并利用四唑盐比色法（mtt法）和流式细胞仪检测目标蛋白对nih3t3细胞增殖及不同细胞周期下nih3t3细胞比例的影响。【结果】获得了梅花鹿igf1成熟肽基因序列（234bp）；经鉴定，原核表达载体pet-32a-igf-1构建成功；sds-page和westernblotting检测结果表明，在rosetta中成功诱导表达了融合蛋白，且羟胺裂解纯化后的目的蛋白纯度较高；mtt法和细胞周期检测结果表明，复性后的igf-1重组蛋白能促进细胞增殖。【结论】成功克隆了梅花鹿igf-1成熟肽基因序列，获得了具有生物学活性的igf-1蛋白。