α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶(cgt酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基)，-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(cd)能力的影响。将α-cgt酶相应位点分别进行如下突变：k47t，y195i，以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6)，并在大肠杆菌bl21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化，利用hplc分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明，和野生酶相比，所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面，突变酶y195i的催化产物中，α-cd的含量由68％降为30％，β-cd由22.2％提高为33.3％；而γ-cd由8.9％提高为36.7％，含量提高了4倍，取代α-cd成为产物中的主要成分；γ-cd的实际产量为1.1g/l，是野生酶(0.4g/l)的3倍。突变酶k47t和△6的转化产物中α-cd比例有不同程度下降，但仍然是产物中的主要组分，β-和γ-cd的比例都有所增加。由此可见，活性区域中195位氨基酸对于α-cgt酶的活力和催化选择性具有重要的影响，y195i突变体酶最有利于选择性形成γ-cd。纯化后突变酶y195i的酶学性质试验表明，其最适反应温度和野生酶相同，但最适反应ph有所提高，且比野生酶具有更好的ph稳定性。因此，突变酶y195i具有生产制备γ-cd的潜力。