应用h1-u6双启动子rnai载体筛选人泛素结合酶hube2w的rnai有效靶点

hube2w是新近鉴定出的一种i型泛素结合酶,可能在肿瘤发生和dna损伤修复过程中起重要作用。rna干涉是指通过形成局部双链rna进而特异性地降解细胞内同源基因mrna的机制,目前已成为基因功能研究的有力工具。通过构建h1-u6双启动子rnai载体,可以在体内直接转录出针对hube2w基因的两段互补小rna,更接近于生理状态下小干涉rna的作用。利用rt-pcr方法从293ft细胞总rna中扩增出hube2w基因,分别将其连接至质粒pgl3-control、pcmv-myc和pdsred-express-c1中,以便在mrna水平和蛋白水平检测rna干涉效果。rna干涉载体分别与上述报告载体共转染293ft细胞,测定萤光素酶活性和hube2w蛋白表达水平,结果显示靶点125和259能够在mrna水平和蛋白质水平显著降低hube2w的表达。