牛pacgfp-fadd融合蛋白真核表达载体构建及在cho-k1细胞中的表达

fadd是fas/fasl系统的一个信号连接蛋白,通过传递凋亡信号,介导细胞凋亡。为了揭示fadd在牛卵泡发育过程中的调控作用,采用rt-pcr从牛卵巢组织中扩增fadd基因,将其cdna终止密码子删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(acgfp)报告基因的真核表达载体pacgfp-nl中,构建融合蛋白重组质粒,经bglⅱ/ecorⅰ酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染cho-k1细胞,观察有无荧光的表达及用rt-pcr和westernblotting方法检测基因转录、表达情况。结果表明,成功克隆牛fadd基因,通过pcr方法在fadd阅读框两端引入了bglⅱ和ecorⅰ克隆位点,并于起始位点前加入kozak序列,成功构建pacgfp-bfadd融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染cho-k124h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染效率可达65%,通过rt-pcr扩增出654bp的转录产物,并用westernblotting检测到51.4kd目的蛋白的表达。