瞬时基因表达可溶性的vegfr2:i-iv

通过rt-pcr的方法从三个月的流产绒毛组织中克隆目的基因vegfr2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2,血管内皮细胞生长因子受体2)胞外i-iv区,连接到真核表达载体上构建了重组表达载体。首先在无血清悬浮培养的hek293细胞中,使用报告基因gfp(greenfluorescenceprotein,绿色荧光蛋白)优化转染条件,发现在转染时dna:pei=1:2(w/w)、1.5mgdna/106cells及开始转染4h内使用无血清、摇床(120r/min)时可以达到最佳的转染效率和细胞数量。在确定转染条件之后,将构建的表达载体分别在hek293细胞、cos-7细胞和cho-k1细胞中进行瞬时转染表达,结果发现仅在cho-k1细胞的培养上清中检测到目的蛋白的表达。瞬时转染cho-k1细胞至总体积约为1.5l,由于目的蛋白的羧基端有8-his标签,通过ni2+-ida柱纯化得到5mg左右的目的蛋白。