水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3g的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得1.26×105个克隆,文库含外源dna的总长度约为4.8×106kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在ph5.0、37oc条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个2223bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3g)的开放阅读框(orf),其编码产物的氨基酸序列与来自于bacillussp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高,具有60%的一致性和73%的相似性。该orf在e.coli中的表达产物umcel3g的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用ni-nta纯化的umcel3g的酶学特性,其最适ph和最适温度分别为6.0~6.5和45oc。一些金属离子如ca2+、zn2+能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如fe3+、cu2+能抑制umcel3g的活性。在ph4.5、35oc和5mmol/l的ca2+存在的条件下,用ni-nta纯化的重组酶的比活为22.8iu/mg,说明该酶在用sscf工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。